MATOS



La problématique de recherche de notre équipe est l'étude des mécanismes biologiques liés aux altérations du tissu osseux au cours de la vie des individus. Ces mécanismes sont notamment sous l'influence de facteurs génétiques et environnementaux. Notre projet est plus spécifiquement focalisé sur les mécanismes cellulaires (autophagie) et moléculaires (instabilité génétique) affectant les cellules osseuses dans le cadre de certaines pathologies du remodelage de la matrice (ostéoporose, ostéosarcome, syndrome de Rhotmund-Thomson), ou associés aux effets de l'environnement (toxicité chimique de l'uranium aux faibles doses). L'étude du tissu osseux se fait à différentes échelles, du moléculaire jusqu'à l'individu entier, et de nombreuses méthodes d'imagerie cellulaire in vitro (reconstructions de mosaïques, immunofluorescence HD, microscopie électronique à transmission), ex vivo (micro-tomodensensitométrie X HR), et in vivo (radiographie–X HR), sont mises en œuvres et développées au sein de l'équipe ainsi que dans le cadre d'un consortium sur la biominéralisation de l'uranium soutenu par le programme transversal de toxicologie du CEA (imagerie synchroton SOLEIL – collab C. Den Auwer).

Parallèlement, un autre projet interdisciplinaire visant à développer des technologies innovantes d'exploration fonctionnelle utilisant des systèmes d'antennes/microcapteurs implantés sans batterie et sans fils a été initié en étroite collaboration avec le Laboratoire d'Electronique des Antennes et Télécommunications de Sophia Antipolis (UMR 7248 CNRS/UNS). Ce projet interdisciplinaire intégré au Labex UCN@SOPHIA est actuellement en cours de valorisation avec dépôt de brevet.

A) Biologie osseuse et Autophagie

Le tissu osseux est en perpétuel renouvellement et le remodelage est réalisé grâce à plusieurs types cellulaires : les ostéoclastes qui sont impliqués dans la résorption, les ostéoblastes qui sont en charge de la construction, et les ostéocytes qui sont actuellement considérés comme les chefs d'orchestre du remodelage osseux. Cet axe de recherche est centré sur l'analyse du rôle de l'autophagie dans l'ostéoblaste (OB), cellule chargée de la production de la matrice osseuse et de sa minéralisation. La macroautophagie (autophagie) est un processus catabolique majeur dans les cellules eucaryotes, qui permet la dégradation et le recyclage des macromolécules et des organelles endommagées. Lors de ce processus, du matériel cytoplasmique est inclus dans une structure à double membrane appelée autophagosome puis dégradé après fusion avec le lysosome, permettant ainsi le recyclage de macromolécules. L'autophagie existe au niveau basal dans toutes les cellules et joue un rôle très important dans l'homéostasie et le contrôle de qualité intracellulaire. Par ailleurs, l'autophagie est stimulée en conditions de stress pour permettre à la cellule de survivre le temps que les conditions s'améliorent. Bien que l'autophagie soit initialement un mécanisme de survie, une autophagie exacerbée peut conduire à une mort cellulaire. Enfin, des résultats récents ont permis d'établir un lien entre l'autophagie et certains processus de sécrétion. L'objectif de ce projet est donc de définir le rôle de l'autophagie dans les cellules osseuses au cours de la vie des individus en s'intéressant plus spécifiquement aux situations pathologiques (ostéoporose, ostéosarcome) et aux effets de l'environnement (toxicité chimique de l'uranium naturel aux faibles doses).



Les travaux que nous avons réalisés ces deux dernières années indiquent que l'autophagie est un nouvel acteur clé dans le processus de minéralisation des OB. Nous avons en effet pu montrer dans une lignée d'OB tumoraux et dans des OB primaires murins, qu'un défaut d'autophagie conduit à une diminution de la minéralisation. Dans ce travail, nous avons notamment mis en évidence que des structures en forme d'aiguilles correspondant à des cristaux de phosphate de calcium sont inclus dans des vésicules autophagiques qui pourraient permettre leur relargage dans l'espace extracellulaire et participer ainsi à la minéralisation de la matrice osseuse. Parallèlement, l'analyse des os de souris déficientes en autophagie dans les OB suggère qu'un défaut d'autophagie est associé à une perte de masse osseuse. Ce projet a été financé par le CNRS, le CEA, la Société Française de Rhumatologie, et les Anges de Verre.


Reconstruction 3D de l’os trabéculaire (extrémité distale du fémur) de souris déficientes en autophagie dans les ostéoblastes (micro-CT HR – SkyScan-1076)


Parallèlement à l'étude de l'autophagie dans les ostéoblastes normaux, nous nous intéressons également à l'étude de ce mécanisme au sein des cellules souches tumorales (CSC) d'ostéosarcome. De nombreux travaux tendent à démontrer que ce type cellulaire, résistant aux traitements de chimiothérapie et radiothérapie, est à l'origine des récidives observées. Ce projet est financé par l’Association France-Cancer.

B) Instabilité génétique et physiopathologie osseuse

             RECQL4 +/-                           RECQL4 -/-
   
                         Radiographie-X HR                                                         Microscopie haut débit
                         Vertèbres caudales de souris                                           Ostéoclastes

L'objectif de ce projet est de comprendre le lien entre la stabilité du génome et la physiopathologie du tissu osseux sous l'influence de facteurs génétiques ou environnementaux. Dans ce but, nous utiliserons un modèle murin dans lequel le gène RECQL4 codant pour une ADN-hélicase a été invalidé. Les patients dont le gène RECQL4 est muté présentent un syndrome progéroïde (syndrome RTS pour Rothmund-Thomson Syndrome), associé à des anomalies osseuses, une forte ostéoporose et une prédisposition aux ostéosarcomes. Bien que des données récentes indiquent que RecQL4 soit impliquée dans différents aspects du métabolisme de l'ADN et qu'elle est essentielle pour la stabilité du génome, les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant aux phénotypes osseux chez les patients RTS ne sont pas connus. Nous attendons de l'étude du rôle de l'ADN-hélicase RecQL4 dans la biologie du tissu osseux qu'elle nous permette de mieux comprendre l'impact d'une instabilité génomique dans la physiopathologie osseuse (ostéosarcome, ostéoporose) et plus particulièrement dans le vieillissement osseux.

C) Composition du tissu osseux et environnement

Dans le cadre de l'étude des modèles présentés ci-dessus, nous nous intéressons également à l'évolution de la composition de la matrice osseuse au cours de la vie des individus sous l'influence de ces facteurs génétiques ou environnementaux. La matrice osseuse contient une multitude de protéines qui ont des rôles distincts dans le contrôle de la structure et de la fonction de l'os. Plusieurs d'entre elles interviennent dans les processus de minéralisation avec des effets à la fois positifs et négatifs ainsi que dans le maintien des propriétés mécaniques, de la stabilité et de l'intégrité de l'os. Nous utilisons différentes approches biochimiques (extraction différentielle des protéines, séparation des protéines par électrophorèses mono et bidimensionnelles sur gel d'acrylamide) associée aux méthodes les plus performantes (shotgun proteomics, séquençage de novo, quantification relative par marquage des peptides avec des sondes isobariques (TMT, Tandem Mass Tag)) d'analyse en spectrométrie de masse disponibles au sein de notre unité et via les plateformes du CEA pour suivre l'évolution de la composition du tissu osseux dans ces modèles expérimentaux.

D) Uranium et Os



1) Effet de l'uranium sur la minéralisation et rôle potentiel de l'autophagie dans les mécanismes de détoxification

L'uranium se dépose à la surface de l'os et l'ion uranyle (UO22+) est supposé être échangé avec les ions calcium à la surface des cristaux de minéralisation sans pour autant participer à leur formation. Bien que le tissu osseux représente la cible privilégiée pour la fixation et le stockage de l'uranium, l'effet de cet actinide sur les OB reste peu documenté. Après addition d'uranyle-bicarbonate in vitro, des précipités d'uranyle sous forme de structures en aiguilles ont été observés dans les OB, le plus souvent dans des vésicules de nature inconnue, ainsi que dans l'espace extracellulaire. Lors d'une exposition à de faibles doses d'uranyle-bicarbonate, une restauration de la croissance cellulaire associée à une diminution de la concentration intracellulaire a été observée dans les OB, suggérant l'existence d'un mécanisme de détoxification. Cette restauration de croissance cellulaire est également associée à la formation de précipités d'uranyle. L'ensemble de ces données nous a amené à émettre l'hypothèse que l'autophagie pourrait jouer un rôle dans la détoxification de l'uranyle via le relargage dans le milieu extracellulaire de précipités d'uranyle. Par ailleurs, et bien qu'aucun lien n'ait été décrit entre autophagie et uranium, les métaux tels que le cadmium, le chrome, ou l'arsenic ont été récemment identifiés comme inducteurs d'autophagie. Pour limiter l'accumulation d'UO22+ dans l'os et favoriser son excrétion, de nombreuses molécules décorporantes ont été testées. Cependant, aucune d'entre elles ne présente une réelle efficacité. Notre projet, qui vise à améliorer la connaissance des processus cellulaires et moléculaires conduisant à l'accumulation d'UO22+ dans la matrice osseuse, devrait faciliter, à terme, l'identification de nouveaux agents décorporants. Ce projet entre dans le cadre d'un projet collaboratif interdisciplinaire baptisé BiomUrOs faisant intervenir plusieurs équipes et directions du CEA (iBEB/DSV Marcoule et Nice, ICSM/DEN Marcoule, DSM/iNAC Grenoble) ainsi que l'Institut de Chimie de Nice (UNS/CNRS) et a été notamment financé via le programme transversal de toxicologie du CEA, et fait l'objet d'une demande ANR.

2) Résorption ostéoclastique et Uranium


          Microscopie confocale
          Ostéoclaste
          Marquage phalloïdine/DAPI/GFPP

Faisant suite aux travaux réalisés sur les ostéoblastes, nous avons entrepris l'étude des effets de l'uranium sur les ostéoclastes placés sur un support plastique ou biomimétique résorbable. Ce dernier substrat va permettre de mimer les interactions des cellules osseuses avec l'uranium libre ou piégé au sein de cette matrice biomimétique dans un microenvironnement plus physiologique. Ce projet URANOs qui vient d'être initié, entre également dans le même consortium d'équipes de biologistes cellulaires et moléculaires, biochimistes et chimistes et est financé par le programme PTTox du CEA.

3) Protection des effets de l'uranium sur l'os

Enfin, notre équipe s'intéresse à des traitements préventifs permettant d'inhiber la fixation de l'uranium sur l'os, en particulier via l'utilisation de biphosphonates (BP) de dernière génération tels que l'acide zolédronique. Les BP sont en effet capables de lier les phosphates et de se fixer avec une très forte affinité à la matrice osseuse. Cette propriété leur permet ainsi d'agir comme compétiteur vis à vis de l'uranium. Ce projet est réalisé en collaboration avec le Pr. C. Den Auwer (Institut de Chimie de Nice - UNS).